Мониторинг коагулограммы


Коагулограмма - Мониторинг системы свертывания крови

Существует ряд патологических состояний, при которых показатели стандартных коагуляционных тестов в коагулограмме остаются в норме, тем не менее, сохраняется высокий риск тромботических осложнений. Как правило, такой риск связан с белками межклеточной адгезии и регуляторами свертываемости (система антикоагулянтов и плазминовая система). Уровень этих белков можно определить мето­дом ИФА. Technoclone является одним из лидеров в разработке ИФА тест-систем для оценки тромботичес-кого риска. Важная особенность этих наборов - определение не только концентрации, но и функциональной активности белков.

Молекулы, ассоциированные с клеточным звеном гемостаза (коагулограмма)

Тромбоцитарный фактор 4 (PF4)

PF4 высвобождается в плазму из а-гранул тром­боцитов при их активации. PF4 характеризуется анти­гепариновой активностью, формируя с ним стехио-метрический комплекс. Повышенный уровень PF4 наблюдается в различных ситуациях при сильной активации тромбоцитов, например, при воспалениях инфекционной природы, ДВС-синдроме, первичной полицитемии, цереброваскулярных нарушениях, диа­бете, заболеваниях почек, онкологических заболева­ниях и при экстракорпоральной циркуляции крови. Сниженный уровень PF4 ассоциирован с синдромом серых тромбоцитов.

Количество и активность фактора Виллебранда (vWF)

vWF - сложный мультимерный адгезивный гли-копротеин, синтезируемый эндотелиальными клет­ками и мегакариоцитами, циркулирующий в плазме крови со средним периодом полураспада около 18 ч, его концентрация в норме составляет примерно 10 мкг/мл. Образование vWF в сосудах разных областей существенно различается. В легких, сердце, скелет­ных мышцах выявлен высокий уровень м-РНК vWF, а в почках и печени - низкий. Особая роль vWF в гемос­тазе определяется его структурой, представляющей собой серию различных по размеру (от 0,5 до 20 млн. Да) мультимеров, состоящих из многократно повторя­ющихся субъединиц, в которых имеются домены свя­зывания с гликопротеиновыми рецепторами тром­боцитов (GPIb и IIb/IIIa), коллагеном, гепарином, VIII фактором свертывания крови. vWF является носите­лем-стабилизатором для прокоагулянтного протеина FVIII:C, циркулируя в сыворотке в виде нековалентно связанного комплекса. vWF может взаимодействовать с коллагеном и, возможно, другими эндотелиальны-ми структурами, опосредует адгезию тромбоцитов к субэндотелию через связывание поверхностного рецептора тромбоцитов гликопротеина Ib.

Он также может участвовать в тромбоцит-тромбоцитарном вза­имодействии через связывание гликопротеина IIb/IIIa. Особо следует отметить значение гемодинамических факторов для адгезии тромбоцитов с участием vWF. Опосредованная vWF адгезия тромбоцитов, проис­ходит наиболее интенсивно при высоких скоростях сдвига, т.е. в артериях. Повышенные уровни vWF и его активности являются индикатором повреждения эн­дотелия при сосудистых заболеваниях.


При многих патологиях, сопровождающихся острым и хроническим повреждением эндотелия (сахарный диабет, атеросклероз, опухоли различ­ной локализации, гестоз и т.д.), уровень vWF в коагулограмме крови значительно повышается.

Тем не менее, краткое повышение vWF в коагулограмме после физической нагрузки, введе­ния адреналина или вазопрессина, а также во вре­мя беременности может быть скорее показателем активации или стимуляции эндотелиальных клеток, чем повреждения.

Снижение концентрации vWF в коагулограмме об­наружено при гипотиреоидизме и системной крас­ной волчанке. Приобретенные формы заболевания описаны при аутоиммунных нарушениях, болезни Вальденстрема, доброкачественных моноклональ-ных гаммапатиях, карциноме надпочечников и ревматоидных васкулитах. Болезнь Виллебранда - врожденный геморрагический диатез, впервые описанный фон Виллебрандом в 1926 г., в легкой форме является самым частым геморрагическим нарушением у мужчин, с частотой 1:100. Это заболе­вание гетерогенной природы, вызываемое либо де­фектами структуры белка, либо снижением концен­трации vWF.

Классификация заболевания основана на клинической картине, анамнезе и результатах лабораторного анализа и коагулограммы, включая время свертыва­ния и определение концентрации и активности vWF. Определение уровня и активности vWF помогает в дифференциальном диагнозе двух основных типов заболевания: типа 1 и 2. Определение типа болезни принципиально, так как от этого зависит выбор так­тики ведения больного.

Два варианта иммуноферментных тест-систем производства компании TECHNOCLONE позво­ляют идентифицировать низкое содержание и низкую функциональную активность vWF в плазме (по способности связываться с сорби­рованным коллагеном).

ADAMTS-13 и его ингибитор

ADAMTS-13 - металлопротеиназа, принадлежа­щая к семейству пептидазных белков «ADAM» (A Disintegrin And Metalloproteinase). Биологическая роль протеиназ этого семейства - расщепление экстрацеллюлярного домена трансмембранных белков. ADAMTS-13 по своим функциям не является исключением, она отщепляет фрагменты от мульти-мерной молекулы vWF. Мультимер vWF синтезиру­ется эндотелиальными клетками и высвобождается N-концом во внеклеточное пространство, оставаясь С-концом связанным с мембраной эндотелиальной клетки. Отщепленные фрагменты мультимера vWF тоже обладают адгезивными свойствами, причем активность vWF тем выше, чем больше мономеров включено в его состав. ADAMTS-13 способна отщеплять фрагменты vWF как от трансмембранной, так и от плазменной формы мультимера.


Таким образом, ADAMTS-13 необходима, во-пер­вых: для высвобождения vWF в плазму, а во-вторых: для регулирования чрезмерной его активности. Не­достаток активности ADAMTS-13 приводит к тяжело­му аутоиммунному заболеванию - тромботической тромбоцитопенической пурпуре (ТТП). В этом случае мультимеры vWF остаются заякоренными на мемб­ране эндотелиальной клетки, а концентрация в vWF в плазме остается низкой. В свою очередь тромбоци­ты адгезируются на этих «заякоренных» мультимерах vWF, и в результате в неповрежденном сосуде раз­вивается локальный тромб. Недостаток активности протеиназы может быть обусловлен либо мутацией в активном центре, либо наличием аутоантител. Эти антитела называют ингибитором ADAMTS-13. ТТП - довольно редкий синдром (ежегодно в мире появ­ляется 4-6 больных на 1'000'000 человек). Однако без соответствующей диагностики и лечения смертность при ТТП составляет порядка 95%.

Диагностика ТТП оставалась весьма проблема­тичной, поскольку только по концентрации ADAMTS-13 сложно поставить диагноз. Так коагулограмма концентрации ADAMTS-13 в группе здоровых (350-730 нг/мл) и в группе пациентов с ТТП (120-360 нг/мл) характеризуются небольшим различием статистически достоверных результатов. Значительно повышает достоверность диагностики определение функциональной актив­ности ADAMTS-13 иммунофлуоресцентным методом.

В образцах с низкой активностью ADAMTS-13 имеет смысл определить антитела к этой протеина-зе, чтобы выявить причину данной патологии (врож­денная или приобретенная форма). Количественное определение специфических антител к ADAMTS-13 проводится с помощью ИФА-наборов компании Technoclone.

Комплекс ADAMTS-13-Фактор XI

ADAMTS-13 образует стабильный комплекс с фак­тором XI и его активной формой - фактором XIa. Та­ким образом, часть ADAMTS-13 циркулирует в плазме в виде комплекса и в таком виде не проявляет фер­ментативной активности. Определение комплекса ADAMTS-13/Фактор XI позволяет выяснить этиологию дефицита ADAMTS-13 (сниженная экспрессия или пе­реход свободной формы в связанную).

Тромбопоэтин (MGDF)

Тромбопоэтин, также известный как фактор роста мегакариоцитов (MGDF), Mpl-лиганд или колониести-мулирующий фактор мегакариоцитов (MK-CSF) - глико-зилированный полипептид с м.м. 60-70 кДа, синтезируе­мый гепатоцитами и стромальными клетками костного мозга. Тромбопоэтин вызывает повышение количества мегакариоцитов, улучшает их жизнеспособность, уско­ряет клеточный цикл. Уровень циркулирующего тром-бопоэтина определяют при различных патологических состояниях: при идиопатических формах тромбоцито-пенической пурпуры и тромбоцитонемии, при цирро­зе печени и некоторых видах тромбоцитопении. Хотя тромбопоэтин стимулирует пролиферацию мегакари-оцитов (предшественников тромбоцитов), однако пря­мой корреляции между его уровнем и числом тромбо­цитов не наблюдается.

Фибронектин (ФН)

ФН - это гликопротеин с высокой м.м., состоящий из двух практически идентичных полипептидных цепей (каждая по 220 кДа). Он синтезируется и секретируется печенью, нормальная концентрация циркулирующего ФН в кровотоке составляет примерно 330 мкг/мл плаз­мы. ФН принадлежит к семейству адгезивных белков внеклеточного матрикса. Димерная структура позво­ляет ему функционировать как молекулярный клей, соединяющий различные молекулы вместе благодаря его связывающим доменам. Плазменный ФН выпол­няет важную роль в воспалительных, регенеративных процессах и механизмах гемостаза. Снижение уровня ФН в плазме наблюдается при гепатите, сепсисе, физи­ческих травмах, в постоперационный период. ФН яв­ляется белком острой фазы и его уровень может быть повышен во время острой фазы и осложненной бере­менности. С высоким уровнем ФН также связано разви­тие злокачественных опухолей и их метастазирование.

Витронектин(ВН)

ВН - полифункциональный гликопротеин (м.м. 78 кДа), компонент крови и внеклеточного матрикса, вы­полняет функции аналогичные ФН. ВН синтезируется в печени, нормальная концентрация в плазме составля­ет 250-450 мкг/мл. ВН взаимодействует с комплемен­том, гепарином, комплексом тромбин-антитромбин III, что указывает на его возможное участие в иммунном ответе и регуляции свертывания крови.

Одна из важнейших функций ВН в регуляции гемос­таза - стабилизация ингибирующей конформации PAI-1 (ингибитора активации плазминогена 1). В отсутствие ВН PAI-1 остается в латентной форме и не ингибирует активацию плазминогена. Таким образом, он является кофактором серпинового ингибитора - РАМ. ВН вза­имодействует с гликозаминогликанами, коллагеном, плазминогеном, стабилизирует ингибирующую кон-формацию PAI-1. 50% снижение уровня ВН наблюда­ется при ДВС-синдроме и циррозе печени. Отложение ВН на стенках сосудов ассоциировано с атеросклеро-тическими заболеваниями.

Тромбоспондин-lfTSP-l)

TSP-1 - гликопротеид с м.м. 165 кДа, наряду с TSP-2, -3, -4 и -5 составляющий одноименное семейство бел­ков. По строению - это мультимер, состоящий из трех идентичных субъединиц, связанных дисульфидными связями. Наибольшее количество TSP-1 представлено в альфа-гранулах тромбоцитов и секретируется в плаз­му в ответ на их активацию гормонами и цитокинами.

Впервые TSP-1 был выделен из тромбоцитов, стимулированных тромбином, поэтому был назван «тромбин-чувствительный протеин». В настоящее время известно множество биологических функций TSP-1: ангиогенез, апоптоз, активация TGF-(3, регуля­ция иммунного ответа. Биологическая мультифунк-циональность TSP-1 согласуется с наличием множес­тва рецепторов, взаимодействующих с TSP-1, самые важные из которых: CD36, CD47 и различные интег-рины. Так, взаимодействие TSP-1 c СD36, экспресси-рованном на эндотелиальных клетках, ингибирует их пролиферацию и миграцию, т.е. блокирует про­цесс ангиогенеза и косвенным образом усиливает апоптоз эндотелиальных клеток. TSP-1 образует комплексы с коллагеном, гепарином, является силь­ным агрегирующим фактором, опосредуя адгезию тромбоцитов к субэндотелию.

Тромбоспондин-2 (TSP-2)

TSP-2 (THBS-2) - белок семейства тромбоспон-динов с м.м. 150 кДа. Аналогично TSP-1 он вызывает множество биологических реакций: пролиферацию, агрегацию, клеточную подвижность, ангиогенез, заживление ран. TSP-2 регулирует формирование коллагенового матрикса, воздействуя на функцию фибробластов. Также TSP-2 обеспечивает взаимодейс­твие клеток экстрацеллюлярным матриксом, что мож­но отнести к его основной функции. Гепарин-связыва-ющий домен молекулы обеспечивает взаимодействие TSP-2 с различными интегринами, экспрессированны-ми на поверхности эндотелиальных клеток. TSP-2 мо­жет блокировать опухолевый ангиогенез и вызывать апоптоз эндотелиальных клеток сосудов.

телия, либо представлен конформацией, не реагиру­ющей с фактором VII. При повреждении сосудистого эндотелия происходит взаимодействие фактора VII с TF, и образовавшийся комплекс TF/fVIIa активирует через реакции ограниченного протеолиза факторы IX и X. Запуск каскада системы свертывания в итоге приводит к генерации тромбина и образованию фиб-риновых сгустков. Уровень TF повышается при сти­муляции клеток эндотелия, моноцитов и макрофагов эндотоксинами, цитокинами и лектинами, вследствие чего растет и прокоагулянтная активность. Таким об­разом, высокая концентрация ТF ассоциирована с риском тромботического риска, в частности, с разви­тием ДВС-синдрома.

Ингибитор пути тканевого фактора (TFPI)

TFPI - главный ингибитор, блокирующий гипе­рактивацию системы гемостаза при повышенных концентрациях TF. TFPI циркулирует в плазме в виде комплекса с липопротеинами низкой и высокой плот­ности. Около 10% TFPI находится в тромбоцитах, при активации этих клеток тромбином TFPI высвобожда­ется в плазму. Поэтому при агрегации тромбоцитов уровень TFPI повышается. TFPI является ингибитором протеиназ типа Кунитца, причем обладает двумя ха­рактерными доменами. Один Кунитц-домен связывает комплекс TF/fVIIa, другой - фактор Xa. Таким образом, TFPI ингибирует одновременно комплекс TF/fVIIa и фактор Xa. Кроме того, благодаря свойствам С-конце-вого фрагмента, TFPI с высокой степенью аффинности взаимодействует с гепарином, что позволяет допол­нительно эффективно ингибировать фактор Xa. Одна­ко встречается форма TFPI укороченная в С-концевом фрагменте, у этой формы аффинность связывания с гепарином уменьшается, вследствие чего гепарин неэффективно ингибирует фактор Xa. Очевидно, что в этом случае антикоагулянтная гепариновая терапия не дает должного эффекта. ИФА-наборы позволяют дифференцировать формы TFPI и определять концен­трацию формы TFPI с укороченным С-фрагментом. От­дельная тест-система предназначена для выявления комплекса TFPI/fXa.

Молекулы плазменного звена гемостаза

Тканевой фактор (TF)

TF (тромбопластин или фактор III) представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, функцио­нирующий как рецептор и кофактор фактора VII (зи-могенной и активной форме), инициирующий актива­цию внешнего пути системы свертывания. В норме TF либо отсутствует на поверхности сосудистого эндо-

Фактор VII (fVII)

fVII - зимогенная форма фермента «А/Иа», активи­рующего внешний путь каскада свертывания. Актива­ция fVII приводит к последующему запуску реакций коагуляции с участием факторов IX, X, XII и тромбина. Активная форма fVII может стимулировать зимогенную форму этого фактора (самоактивация по принципу обратной положительной связи). Ферментная актив­ность fVII значительно возрастает при образовании комплекса с TF. ИФА-наборы позволяют определять как общее количество фактора (fVII, ^Иа, комплексы TF/fVII и TF/А^Иа), так и только активную форму - ^Иа и TF/fVIIа. Активная fVII играет роль в развитии ише-мической болезни сердца. Нормальная концентрация fVII в плазме - около 500 нг/мл, и лишь около 1% находится в активной форме, т.е. примерно 5нг/мл.

Фактор VIII

Фактор VIII - гликопротеин, ключевой участник внутреннего пути системы свертывания, активирую­щий фактор X. ИФА позволяет определять нативную и рекомбинантную формы этого белка.

Фибринопептид А (FPA)

FPA образуется при ферментативном действии тромбина в результате отщепления от N-конца Aa-цепи фибриногена. Повышенный уровень FPA в крови говорит о гиперактивности тромбина и наряду с Д-димером является маркером ДВС-синдрома и риска развития тромбозов. Однако полная корреляция с уровнем Д-димера не обязательна, поскольку FPA об­разуется на стадии формирования фибринового сгус­тка, а Д-димер генерируется при его лизисе.

Антикоагулянтная система Протеин С (PrC)

PrC - главный ингибитор процессов коагуляции. Его концентрация у здорового человека составляет 230 ± 140 нг/мл. Относительно концентрации PrC у новорожденных в норме отметим, что она низкая и достигает нормального уровня взрослого человека примерно к двум годам. Приблизительно у 10% паци­ентов склонных к тромбозам концентрация PrC значи­тельно снижена.

PrC - витамин К-зависимая сериновая протеаза, которая ингибирует коагуляцию путем инактивиро-вания факторов Va и VIIIa. Кроме того, было показано, что PrC обладает профибринолитической активнос­тью. Наследственный гетерозиготный дефицит PrC ассоциирован с повышенным риском тромбоза вен, а общая гомозиготная недостаточность этого белка была выявлена у новорожденных с purpura fulminans (быстротекущей формой геморрагического васкули-та: болезни Шенлейна-Геноха).

Уровень PrC может значительно возрастать при фиброзах легких различной этиологии, например, при идиопатическом фиброзе легких (ИФЛ), саркоме Бека (саркоидозе), коллагеновых васкулитах, ассоци­ированных с интерстициальным поражением легких (КВ-ИПЛ)

Снижение уровня PrC может быть связано с де­фицитом витамина K, а также с кумариновой терапи­ей. При этой терапии концентрация PrC снижается прежде, чем снижаются концентрации факторов II, IX и X. Таким образом, происходит временный дис­баланс свертывающих и антикоагуляционных фак­торов, который может стимулировать локальную коагуляцию в венулах, что приводит к тромбозу. Поэтому кумариновая терапия должна обязательно проводиться при мониторинге концентрации или активности PrC.

Для определения уровня PrC наиболее простым и надежным методом является ИФА. Время постановки анализа составляет всего 45 мин. Определение актив­ности PrC можно проводить хромогенным методом в ИФА-формате, в 96-луночном планшете при длине волны 405 нм.

Ингибитор протеина С (PrCI)

PrCI (57 кДа) - ингибитор сериновых протеаз (се­мейство серпинов) гомологичный а-1-антихимотрип-сину, а-1-антитрипсину и антитромбину III. PrCI спо­собен ингибировать PrC, двухцепочечную урокиназу, двухцепочечный t-PA, тромбин, фактор Xa, фактор XIa. Поскольку PrCI ингибирует множество плазменных ферментов, его биологическая роль пока точно не выяснена.

Нормальная концентрация PrCI в плазме - 4 мкг/мл, в моче 250 нг/мл, в семенной жидкости 200 мкг/мл.

Пониженная функциональная активность PrCI обнаруживается у пациентов с ДВС, заболеваниями печени. Напротив, повышение активности PrCI наблю­дается у пациентов, перенесших инфаркт миокарда. Комплексы u-PA- PrCI выявляются у пациентов, про­ходящих тромболитическую u-PA-терапию, когда кон­центрация u-PA превышает концентрацию PAI-1.

ИФА тест-система компании TECHNOCLONE позво­ляет определять активность PrCI по его способности связываться с урокиназой, которая сорбирована на планшете.

Протеин S (PrS)

Тканевой активатор плазминогена (t-PA)

PrS - гликопротеин, относящийся вместе с PrC и антитромбином III к системе антикоагулянтов. В норме PrS представлен в плазме двумя формами: свободной (около 40% от общего количества) и в комплексе с фрагментом комплемента С4Ь ^b-BP-форма). Только свободная форма PrS является кофактором для активи­рованного PrC для ингибирования факторов Va и VII^.

PrS синтезируется печенью через витамин К-зависи-мый механизм. Соответственно при непрямой антикоа-гулянтной терапии (например, при введении варфари-на) уровень PrS наряду с PKI падает. Поэтому непрямая антикоагулянтная терапия требует контроля уровня этих протеинов во избежание тромботических осложнений.

Определение свободной формы PrS и его общего количества служит для дифференциальной диагности­ки трех типов дефицитов этого фактора: тип I - снижен­ный уровень общей и свободной форм, тип II - нормаль­ный уровень общей и свободной форм при сниженной активности, тип III - нормальный уровень общей формы при недостатке свободной. ИФА-метод позволяет спе­цифично определять свободную форму PrS.

Антитромбин III (At-III)

At-III - это альфа2-глобулин с м.м. 58 кДа, наряду с PrC является важным участником системы антикоагулянтов. В норме уровень At-III в плазме составляет 50-150 мкг/мл (50-150%). At-III связывает все активированные факторы свертывания, относящиеся к сериновым протеазам, за исключением fVII. Его активность резко увеличивается при взаимодействии с гепарином и гепариноподобны-ми молекулами на поверхности эндотелия. При связы­вании остатков лизина At-III с гепарином в его молекуле происходят конформационные сдвиги, способствую­щие быстрому взаимодействию реактивного сайта At-III с активным центром тромбина. Это свойство гепарина лежит в основе его антикоагулянтного действия. Не­достаток функциональной активности At-III приводит к тромботическим осложнениям. Для определения фун­кциональной активности At-III используется хромоген-ный метод, который можно проводить в ИФА-формате в 96-луночном планшете.

Плазминовая (фибринолитическая) система

К активаторам плазминогена относятся фактор XIta, тканевой плазминогеновый активатор (t-PA), уро-киназа (u-PA). Действие активаторов регулируется ингибиторами активации (PAI-1, а2-антиплазмин). От соотношения активаторов-ингибиторов плазминовой системы зависит скорость фибринолиза и риск тром-ботических осложнений.

t-PA - гликопротеин с м.м 70 кДа, являющийся ос­новным активатором фибринолитической системы. Он синтезируется эндотелиальными клетками и сек-ретируется в кровоток после воздействия различных стимулов, например, таких как венозная окклюзия или физическая нагрузка.

Концентрация циркулирующего t-PA в плазме со­ставляет примерно 2-8 нг/мл. Однако 95% циркулиру­ющего t-PA входит в состав комплекса с ингибитором активатора плазминогена (PAI-1), следовательно, нахо­дится не в активном состоянии. При венозной окклю­зии концентрация t-PA увеличивается до 15 нг/мл или выше, соответственно, возрастает и его активность. Такое повышение происходит как благодаря увеличе­нию выброса t-PA эндотелиальными клетками, так и за счет снижения вымывания t-PA из места окклюзии.

Уровень t-PA снижен у пациентов с тромботичес-кими нарушениями (тромбоз глубоких вен, инфаркт миокарда, ишемических инсульт), при злокачествен­ных новообразованиях и сепсисе.

Уникальный ИФА-набор для определения фер­ментативной активности и количества t-PA после­довательно в одной пробе позволяет проводить дифференциальную диагностику многих патологий, связанных с нарушениями в плазминовой системе. Активность t-PA может быть измерена только в об­разцах, из которых предварительно были удалены его ингибиторы. В методе Actibind это легко достигается специфической иммуноадсорбцией t-PA, содержаще­гося в образцах плазмы, с помощью антител, иммоби­лизованных на поверхности лунок микропланшетов. Результаты анализа можно разделить на группы и предположить причины возникших патологий. 1. Повышенный уровень и активность t-PA. Такие результаты свидетельствует об увеличении выбро­са t-PA, который не сбалансирован соответствую­щим усилением выброса PAI-1. Это указывает на первичный гиперфибринолиз и, вероятно, приве­дет к образованию плазмина, расходу ингибиторов плазмина и деградации других белков плазмы, та­ких как фибриноген и фактор VIII.

2. Повышенный уровень и нормальная активность t-PA. Повышенный уровень t-PA антигена при нор­мальной его активности говорит о сниженной де­градации t-PA, что наблюдается при различных за­болеваниях печени и при гепариновой терапии.

3. Пониженный уровень и активность t-PA - свиде­тельствуют о низкой секреции t-PA. Приблизитель­но 10% всех пациентов страдающих тромбозом по­падают в эту группу.

4. Пониженная активность при нормальном уров­не t-PA. В отличие от предыдущей группы, у таких пациентов происходит нормальная секреция t-PA антигена в ответ на венозную окклюзию или иную стимуляцию. Однако слишком высокий уровень PAI-1 нейтрализует увеличившуюся активность t-PA, в результате наблюдается высокий уровень комплекса «t-PA/PAI-1». Приблизительно 20% паци­ентов с тромбофилией попадают в эту группу. Вы­сокий уровень комплекса «t-PA/PAI-1» также имеет место при дисфункции печени, связанной с нару­шениями свертываемости крови. Важно отметить, что около 90% t-PA присутствует в плазме в виде комплекса «t-PA/PAI-1».

Тест по определению активности и количества t-PA можно порекомендовать в качестве предварительного скрининга всей плазминовой системы. Для дальнейше­го исследования фибринолитического звена в зависи­мости от результатов проводятся тесты на определе­ние количества комплекса «t-PA/PAI-1», количества или активности PAI-1, уровня Glu-плазминогена.

Урокиназный активатор плазминогена (u-PA, урокиназа)

u-PA, продуцируется почечной тканью, наряду с t-PA является активатором плазминогена. От концентра­ции и активности урокиназы в большой степени за­висит инициация процесса фибринолиза. Основная функция u-PA - активация плазмина, что использу­ется в медицинской практике для антитромботичес-кой терапии. Поскольку опухолевые клетки харак­теризуются повышенным синтезом u-PA, его также используют в качестве онкомаркера/ Уровень u-PA повышается при онкологических заболеваниях мо­чеполовой системы и желудочно-кишечного тракта. Также u-PA является прогностическим маркером при раке молочной железы. Диапазон нормальных зна­чений u-PA определен как 1,2-2,4 нг/мл. Уровень u-PA в плазме выше 10 нг/мл может быть вызван онколо­гическим заболеванием.

Уникальный ИФА-набор для определения фер­ментативной активности и количества u-PA после­довательно в одной пробе позволяет проводить дифференциальную диагностику многих патологий, связанных с нарушениями в плазминовой системе.

Ингибитор активации плазминогена I типа (PAI-1)

PAI-1 инактивирует действие активаторов плаз-миногена (t- и u-PA). PAI-1 - белок острой фазы, его концентрация в плазме возрастает вместе с ростом уровня ИЛ-1. Повышенный уровень PAI-1 отмечается при тромбозах, раке, болезнях печени, в послеопера­ционном периоде, при септическом шоке, при инфар­кте миокарда и коронарных заболеваниях. Резким повышением уровня PAI-1 характеризуется синдром привычного невынашивания беременности.

Для определения активной формы PAI-1 используется набор «Actibind PAI-1 ELISA», где в основу положено свойство ингибитора связываться с t-PA. Только активная и свободная форма PAI-1 останется иммобилизованной в лунке планшета, что выявляется специфичными коъюгированными антитела­ми. Результаты выражаются в Ед/мл и в норме попадают в диапазон: 1-7 Ед/мл. Уровень активного PAI-1 выше 20 Ед/мл может указывать на снижение фибринолитической способ­ности и на склонность к тромбозам.

Для определения общей концентрации PAI-1 ис­пользуется набор «Antigen PAI-1 ELISA». Диапазон нормальных значений концентрации PAI-1 опреде­лен как 7-43 нг/мл. Уровень PAI-1 свыше 100 нг/мл го­ворит о сниженной фибринолитической активности и повышенном риске тромботических осложнений. Тест-система «Antigen PAI-1 ELISA» определяет сво­бодную и связанную, активную и неактивную формы PAI-1. На точность результатов не влияет присутствие других PAI (-2 или -3).

Измерения должны быть проведены для снижения риска тромбоза у пациентов с повышенным уровнем PAI-1 в плазме. Набор «Actibind PAI-1 ELISA» измеряет только свободную, активную форму PAI-1. На резуль­таты теста не влияют остальные формы PAI-1 или дру­гих ингибиторов активаторов плазминогена.

Ингибитор активатора плазминогена II типа (PAI-2)

PAI-2 наряду с PAI-1 ингибирует процесс активации плазминогена. Но если PAI-1 обладает большим сродс­твом к t-PA, то PAI-2 действует в основном на u-PA. Не­смотря на очень низкую концентрацию PAI-2 в крови (в периферической крови его уровень, как правило, ниже уровня детекции), он является главным ингибитором u-PA. Его уровень значительно повышается (до 550 нг/мл) в третьем триместре беременности. Уро­вень PAI-2 значительно выше при злокачественных опухолях по сравнению с доброкачественными. PAI-2 встречается в двух формах и в зависимости от степени гликозилирования имеет м.м. 48 или 60 кДа. Первая форма выявляется в плацентарной ткани, а вторая в крови и асцитической жидкости в период беремен­ности. ИФА тест-система выявляет обе формы, причем в свободном и связанном виде (PAI-2 и комплекс PAI-

2/u-PA).

Комплекс t-PA/PAI-1

В плазме концентрация PAI-1 значительно пре­вышает концентрацию t-PA. Причем при венозной окклюзии, которая вызывает высвобождение t-PA в плазму, компенсаторно повышается уровень PAI-1. Повышение уровня комплекса t-PA/PAI-1 коррелиру­ет с уровнем активного, свободного PAI-1. Около 95% циркулирующего t-PA находится в составе комплекса с PAI-1.

Ряд патологических состояний ассоциирован с повышенным уровнем t-PA. Основной орган, где про­исходит деградация t-PA - печень, при различных на­рушениях функций печени наблюдается повышение уровня t-PA, и как следствие происходит увеличение концентрации t-PA/PAI-1. В норме, у здоровых людей уровень t-PA увеличивается с возрастом, концентра­ция t-PA/PAI-1 комплекса соответственно также. Ко­личественное определение t-PA/PAI-1 комплекса по­могает в интерпретации результатов при изменениях концентрации t-PA и/или PAI-1. Поскольку печень не только орган, где происходит деградация t-PA, но так­же орган, синтезирующий PAI-1, то количественное определение комплекса t-PA/PAI-1 служит индикато­ром, показывающим, сколько активного PAI-1 требу­ется для нейтрализации t-PA, если деградация t-PA в печени снижена. Повышенный уровень комплекса t-PA/PAI-1 также имеет место при дисфункции печени, связанной с нарушениями свертываемости крови. Нормальный уровень комплекса t-PA/PAI-1 в плазме находится в диапазоне 7-20 нг/мл.

Комплекс плазмин-а2-антиплазмин

а2-антиплазмин (а2-АП) - одноцепочечный гли-копротеид (70 кДа), относится к семейству серпиновых ингибиторов, синтезируется в печени (время полу­жизни - 3,3 дня) и способен соединяться с плазмином и фибрином. Ингибирование активности плазмина обусловлено формированием неактивного комплек­са с а2-АП. В процессе ингибирования выделяют две стадии. На первой образуется обратимый комплекс между лизин-связывающим участком плазмина и ком­плементарным фрагментом а2-АП, расположенным в СООН-регионе. На второй стадии (при расщеплении пептидной связи ингибитора) формируется необрати­мый комплекс.

Содержание а2-АП в норме - 70 мкг/мл (или 1 мкмоль/л). При свертывании крови а2-АП расходу­ется, переходя в связанную с плазмином форму (в норме концентрации свободного а2-АП падает на 20%). Уровень а2-АП падает и при тромболитической терапии. Уровень комплекса а2-АП-плазмин в норме находится в пределах 0-520 нг/мл плазмы.

Измерение комплекса а2-АП-плазмин позволяет выявлять плазминемию, и, таким образом, геморраги­ческий синдром. При заболеваниях, связанных с по­вышенным образованием фибрина, происходит реак­тивное увеличение уровня плазмина, одновременно повышается концентрация комплекса а2-АП-плаз-мин. При этом наблюдается четкая корреляция между текущей концентрацией комплекса и скоростью об­разования фибриновых сгустков. Определение уров­ня а2-АП-плазмин является ценным индикатором для исследования тромботическо-тромболитическо-го равновесия. Плазмин, связавшись с а2-АП, теряет способность разрушать фибрин. Уровень комплекса а2-АП-плазмин - информативный показатель при тромбозах и геморрагиях.

Плазминоген

Плазминоген - неактивный предшественник плаз-мина (основного фермента фибринолиза). Плазми-ноген синтезируется в печени как одноцепочечный гликопротеин (92 кДа). Активаторы плазминогена (t- и u-PA) расщепляют в молекуле плазминогена одну связь, в результате получается активный двухцепочеч-ный фермент - плазмин. Плазмин катализирует гидро­литическое расщепление пептидов и сложных эфиров аргинина и лизина. Биологическая роль плазмина

- превращение фибрина в растворимые продукты, что способствует рассасыванию тромба. Концентрация плазминогена - один из нескольких факторов, опреде­ляющих уровень фибринолиза in vivo.

Нормальная концентрация плазминогена в плаз­ме примерно 200 мкг/мл, период полужизни белка

- 2,2 дня. Уровень плазминогена часто снижается при острых и хронических формах гепатита. Причи­нами снижения уровня плазминогена может быть и повышенное потребление белка, и подавление его синтеза. При билиарном первичном циррозе печени и на ранней стадии развития желчекаменного син­дрома уровень плазминогена остается в норме или даже может быть повышенным. Заметное снижение уровня плазминогена наблюдается у пациентов в 6

  • см. также:

главу «Система комплемента», стр. 375

  • см. также:

главу «Система комплемента»,

стр. 375

ряде случаев гиперфибринолиза и у новорожденных с синдромом Липстрёма.

Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (TAFI)

AFI (другие названия - прокарбоксипептидаза В или прокарбоксипептидаза U) переходит в актив­ную форму (TAF^) при участии комплекса тромбин/ тромбомодулин. TAFta преимущественно отщепляет лизиновые и аргининовые остатки от С-конца бел­ков.^ Участие TAF^ в фибринолизе заключается в отщеплении лизиновых и аргининовых остатков от фибрина, таким образом происходит частичная деградация фибриновых сгустков. Однако отщепле­ние от фибрина лизиновых и аргининовых остатков ингибирует последующее расщепление фибрино-вого сгустка плазмином. TAFI играет центральную роль в развитии тромбозов, поскольку блокирует лизис фибриновых сгустков.

Карбоксипептидазная активность TAFta в плазме определяется флуорогенным или хромогенным ме­тодами, основанными на расщеплении TAFI-специ-фичного субстрата. Для определения количества TAFI используется ИФА-метод.

С1-ингибитор (C1-INH)

С1-ингибитор - угнетает активность сериновых про-теаз: С1г и C1s субкомпонентов комплемента, а также плазмина, калликреина, фактора XIa, фактора XIta.^

Д-димер

Под влиянием плазмина расщепляется как фиб­рин, так и фибриноген, но Д-димер наряду с другими продуктами образуется только при ферментативном расщеплении фибрина. В настоящее время Д-димер остается наиболее специфичным маркером деграда­ции фибриновых сгустков.

Д-димер - диагностический маркер многих патологических состояний системы гемостаза, со­провождаемых внутрисосудистым отложением фибрина: ДВС (диссеминированное внутрисосудис-тое свертывание), тромбоза глубоких вен нижних конечностей, эмболии легочной артерии, корона-ротромбоза. Определение уровня Д-димера имеет большую клиническую значимость для ортопедии и травматологии пожилого возраста, акушерско-ги-некологической практики, спортивной медицины и при тромботических осложнениях онкологических больных. В норме содержание Д-димера в плазме не должно превышать 250 нг/мл. Повышенные уровни Д-димера выявляются при диссеминированной внут-рисосудистой коагуляции, тромбозе глубоких вен и эмболии легких. Но и другие обстоятельства могут приводить к высокому уровню Д-димера, например, беременность, заболевания печени, инфекции.

Для лабораторной диагностики уровня Д-димера в настоящее время используется три метода: латек-сной агглютинации, ИФА и иммунохроматография. Наиболее чувствительный метод ИФА (порог чувстви­тельности: ниже 60 нг/мл).

Отметим особую диагностическую ценность им-мунохроматографического метода (NycoCard D-dimer) при тромбозе глубоких вен (ТВГ). Если синдром ТГВ не диагностирован во время и не приняты соответству­ющие меры, развитие патологии может привести к легочной эмболии. Международная статистика сви­детельствует о том, что у 1 человека из 1000 за год развивается ТГВ, у 1-5% человек с ТГВ синдромом развитие патологии приводит к смерти, например, от легочной эмболии. До сих пор самым точным методом диагностики ТГВ остается метод функциональной диа­гностики (флебография).

Ниже приводятся данные исследований, где ре­зультаты экспресс-теста (NycoCard D-dimer) были со­поставлены с результатами флебографии. Обследо­вано 150 пациентов с подозрением на ТГВ. Особенно высокая корреляция с данными флебографии отмеча­лась в прогнозировании отсутствия ТГВ.

Метод иммунохроматографии для определения уровня Д-димера (NycoCard D-dimer) сочетает скорость проведения анализа (5 мин.) с доста­точно высокой чувствительностью (пороговое значение: 100 нг/мл). Оперативность проведе­ния анализа требуется при тяжелых тромботи-ческих осложнениях, когда концентрация Д-ди-мера может значительно изменяться в течение одного часа. От точности и своевременности результатов анализа зависят меры предупреж­дения тромбоэмболии и инфаркта.


Коагулограмма -мониторинг

Результат

Тромбоз подтвержден

Тромбоз не подтвержден


теста

флебографией

флебографией

Прогнозирование

положительный

54

32

тромбоза - 63%

(выше Cut-Off)




отрицательный

5

59

отсутствия тромбоза - 92%